精子DNA损伤与男性不育症

男性因素在不孕不育病因中所占的比例已接近50％。多种因素影响了男性生育力，其中精子DNA损伤一直是生殖医学领域近年研究的热点之一。研究表明，精液参数异常的不育男性的精子DNA断裂指标（DFI）高于生育的男性，精液指标正常的特发性不育患者，其DFI也增高；当DFI≥30％时，自然妊娠几乎不可能；DFI具有稳定性，可作为预测男性生育力的基线指标。在辅助生殖技术（ART）临床中，精子DNA损伤是影响其结局的重要因素之一，越来越受到生殖医学工作者的重视。在实施ART前检测精子DNA断裂指标（DFI），采取措施获得DNA损伤较小或无损伤的精子对改善ART结局十分必要。本文旨在综述精子DNA损伤的原因、机制、对策，并强调其与男性不育的相关性。

一、精子DNA损伤的原因

一系列环境因素、污染物和医源性措施均可影响精子DNA的完整性，导致精子DNA损伤。主要如下：

1．药物与放化疗患有癌症（如何金氏淋巴瘤和睾丸癌）的年轻男性精子往往质量较差，精子DNA损伤严重。化疗药物的运用，以及随着药物剂量的累积，会导致绝对的不育，这主要是因为化疗药物对睾丸生精细胞具有毒害作用。放化疗导致睾丸生精细胞受损、精子DNA损伤与患者接受治疗的持续时间以及药物的剂量有关。睾丸生精细胞生精功能的恢复往往在治疗后1个月到1年后，而研究发现，精子DNA损伤贯穿这个过程。

2.生殖道的炎症睾丸后的生殖管道感染和炎症（如睾丸附睾炎，前列腺炎）会导致白细胞精子症出现，氧化应激反应增强，并因此因此导致精子DNA损伤。

3.睾丸部高温研究已经证明，热性疾能够导致射出体外精子的组蛋白与鱼精蛋白比率升高，加重精子DNA损伤。睾丸局部高温同样如此，一些特定的行为能够增加阴囊的温度，如热水浴、电脑前久坐、长期驾车等，它们均能导致精子DNA损伤。

4.精索静脉曲张精索静脉曲张与精DNA损伤关系密切，且损伤的程度与精索静脉曲张患者精液中所发现的高水平的氧化应激反应有关。最近研究表明，精索静脉曲张不育患者的精液中，发现大量发育停滞的精子细胞与高水平的活性氧产物，这些发育异常的精子细胞与DNA损伤有关。而且，在精索静脉曲张得以治疗后，精子DNA的完整性明显提高。

5.激素水平实验研究表明，激素异常能导致染色质缺陷，与野生小白鼠相比，激素受体被敲除的小鼠的精子鱼精蛋白水平、睾酮水平较低，生殖能力受损，DNA损伤程度升高。

二、精子DNA损伤机制

1.精子线粒体DNA损伤精子线粒体DNA是裸露的DNA，缺少组蛋白和DNA结合蛋白的保护；同时，其本身修复损伤的能力很低，且对各种损伤因子极为敏感，尤其是活性氧（ROS）。因此，精子在成熟过程中特别容易出现不同形式的线粒体DNA损伤，包括缺失、变异和多形变态。有研究表明，在异常的精液样本中存在高发的线粒体DNA损伤，这一点表明了其在男性不育中的作用。

2.核体DNA损伤

2.1氧化应激反应在生殖系统各器官和组织中，ROS的产生是一种生理现象，少量适当的ROS在精子生理学方面起着重要作用,有助于精子获能和顶体反应。然而，当ROS大量存在，超过了抗氧化系统的清除能力和精核独特紧密结构的防御能力时,导致精子DNA产生单链或双链的断裂，造成精子DNA损伤。而且，由于精子膜含有高浓度的不饱和脂肪酸，浆膜中含有低度净化酶，在过量活性氧的攻击下易发生脂类过氧化反应，使脂肪酸失去双键,进而精子膜失去流动性,改变内环境，最后导致精核DNA变异或断裂。此外，精子DNA基质易受氧化损伤。有报告显示，当精子接触外源ROS时，DNA断裂明显增加，断裂的形式有全基质模式、产生无碱基位点、缺失、DNA交联和染色体重组。

2.2精子染色质组装精子染色质组装异常导致精子单链和双链DNA断裂，精核DNA损伤，其主要环节是精蛋白替代组蛋白出现异常。在精子发生过程中,染色质的组装需要内源性核酶(拓扑异构酶Ⅱ)参与,以建立和连接DNA缺口,有助于组蛋白被鱼精蛋白替换过程中释放扭力(torsionalstress)和染色质重组,但也可能造成精子发生异常或DNA的损伤。染色质组装出现异常导致精核DNA损伤，也可能是由于DNA双链断裂出现了异常，因为DNA双链的断裂能自然发生于精子发生过程中染色质重组准备阶段和染色质组装的过程中。

2.3细胞凋亡精子发生过程中，凋亡控制精子生成和增殖水平，使之与支持细胞的支持能力相一致，保持精子在数量、形态和功能上的平衡。生精细胞表面蛋白Fas能启动精子凋亡，联合Fas配体（FasL）或兴奋抗Fas抗体激动剂能启动凋亡程序来杀死生精细胞。支持细胞表达FasL，从而限制过度增殖，清除Fas阳性的精子。生育男性Fas阳性精子比例很少,而精液参数异常者Fas阳性精子高达50%,提示其凋亡可能存在异常，清除DNA受损精子的能力不足〔1〕。凋亡异常导致精子DNA损伤的另一个机制与光门蛋白酶有关。内源线粒体膜中的FasL/Fas被阻断导致了光门蛋白酶8和9激活，传导光门蛋白酶受体信号，进而脱氧核糖核酸酶（DNA断裂因子40）活化，最终使精子DNA断裂。McVicar等证实，在射出体外的精子中存在凋亡标记物，生育男性的精子中未发现Fas阳性，弱精和畸形精子的Fas阳性率则较高。大量研究已证实，弱精子和畸形精子的DNA损伤水平较高，再次证明，凋亡与精子DNA损伤有着密切的关系。

2.4鱼精蛋白缺陷鱼精蛋白存在缺陷时，二硫键出现异常，使其不能与DNA紧密结合，从而导致染色质结构松散，双链结构不稳定，出现断裂或在酸性环境下变性为单链，最终导致精子DNA损伤。Aoki等研究证实，鱼精蛋白－1（P1）或鱼精蛋白－2（P2）浓度降低的不育患者精子DNA损伤明显增高，并且，P1/P2值降低时精子DNA损伤显著高于P1/P2值正常和增高时〔。因此，鱼精蛋白缺陷也是导致精子DNA损伤的原因之一。

三、精子DNA损伤的检测方法

目前，检测精子DNA损伤的方法主要有：彗星技术（Comet）、末端转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷（dUTP）末端标记法（TUNEL）、精子染色质结构分析(SCSA)、丫啶橙试验(AOT)和原位切口翻译法（NT）。运用它们能检测出精子在染色质结构和DNA完整性方面存在的缺陷，其中TUNEL和Comet检测DNA单链和双链断裂，SCSA检测染色质结构的异常，NT检测DNA单链断裂。以上还未作为常规方法应用于临床，尚需足量样本的研究来证实其作用及意义。

四、精子DNA损伤与辅助生殖技术

在过去的10多年里，辅助生殖技术（ART）取得了突破性进展，尤其是单精子卵细胞浆内注射（ICSI）技术的应用，使得对严重的少、弱、畸形精子症的治疗取得了重大突破。但大量的研究表明，在ART中，精子DNA损伤影响受精比率、胚细胞发育和妊娠概率，尽管其机制尚不完全清楚，这也使得精子DNA损伤与ART的关系越来越受到重视。

2．宫腔内注射大量的研究证实,精子DNA损伤影响了宫腔内注射（IUI）的结局。其中，运用精子染色质结构分析（SCSA）评估法评估DFI，当其大于30％时，IUI中的受精机率接近于零。此外，用末端转移酶介导的dUTP末端标记法(TUNEL)评估，DFI12％时，不能发生妊娠，达到10％到12％之间时，会导致流产。因此，在IUI中，评估DFI具有较好的预后作用。

3.体外受精在体外受精（IVF）中,精子DNA损伤影响受精机率和胚泡发育。同时，与常规精子参数相比，胚胎质量是较好的IVF妊娠指标，而精子DNA损伤与胚胎质量之间显著负相关。Henkel等报道，当DFI36.5%时，IVF中的妊娠率显著下降；Tomlinson等研究表明，IVF中DFI阈值为27％对于成功妊娠是必须的。因此，DFI可能是IVF中较好的预后评估手段。

4．单精子卵细胞浆内注射在ICSI中，虽然精子DNA损伤不能阻止受精和核体后形式出现，甚至运用DNA损伤较高的精子可以实现妊娠，但DNA损伤与受精和妊娠率之间仍显著负相关。Virro等在实施ICSI时发现，当DFI30％时，易出现低胚泡率（low blastocyst rates），且不能发生妊娠。临床上，ICSI成功的受精率通常不高于65％—80％，可能是因精子存在DNA缺陷。用存在DNA缺陷的精子进行ICSI时，其被直接注入卵子，重要的是精子遗传物质的完整性，因其绕过自然选择,会影响胚细胞和胚胎发育以及子代的健康。因此，在进行ICSI前,首先对精子DNA进行评估十分必要。

5．冷藏技术大量的报道显示，在诸多精子冷藏技术中，对精子的冻融能损伤精子DNA完整性。而且，缺乏精子低温保护的精子冷冻试验的结果显示，与新鲜精子（19±16%，p0.05）相比，在经过1个、3个和5个冻融周期后的精子DNA断裂显著增高（分别为65±6％、76±11％和92±6％）。然而，冻融损伤精子DNA完整性的机制尚未完全阐明，可能是由于冷冻保护剂对精子脱水，精子膜内的胞浆水分减少，从而使得染色质过渡聚集，导致染色质浓缩、转录停止,精子不能进行DNA修复；也可能是由于复苏时精核的离子环境发生巨大改变引起的适应性变化导致了精子DNA与其相应的鱼精蛋白出现轻度分离。

6．精子体外处理技术精子体外处理技术在改善精子质量方面优于内外科疗法,已广泛应用于体外人工受精技术中，其与精子DNA完整性也密切相关。Donnelly等用Percoll法对25例患者的精液进行梯度离心处理，然后用彗星试验及TUNEL法对DNA链断端标记以检测原精液及处理后样本精子DNA链的完整性，结果证明，经处理后的精子DNA链完整性有显著性提高。然而，对精子进行不适当的体外处理会导致DNA损伤。体外处理时间过长，离心步骤过多，离心速度过快，均会造成精子的物理损伤并形成过氧化物或其他氧残留物，活性氧也会大量增加，造成精子DNA氧化损伤。